Определение глюкозы в сыворотке в крови: глюкозооксидазный и гексокиназный методы

Глюкозооксидазный способ определения глюкозы

Определение глюкозы в сыворотке в крови: глюкозооксидазный и гексокиназный методы

Для определения концентрации исключительно глюкозы в различных жидкостях организма человека используют глюкозооксидазный метод. Преимуществом этого теста является его точность.

Диагностика в отличие от экспресс-методов позволяет выявить количество чистой глюкозы, без домеси к ней фруктозы и других сахаров. Принцип этой реакции заключается в окрашивании раствора, которое происходит вследствие взаимодействия окислителей со специфическими красителями.

Оценка результатов исследования проводится с помощью метода колориметрии и сравнения со стандартными растворами.

Когда назначается проведение глюкозооксидазного метода?

Этот тест используют для выявления нарушения толерантности к сахару и развития преддиабета, а также в стадии разгара болезни. Но для таких целей анализ используют редко, это связано с его высокой стоимостью и длительным ожиданием результата. Чаще всего определение глюкозы в крови и моче с помощью этого метода применяют при дифференциальной диагностике таких заболеваний, как:

  • синдром непереносимости лактозы;
  • непереносимость фруктозы;
  • выделение фруктозы с биологическими жидкостями организма;
  • повышенная концентрация пентозы в моче.

Что в основе этого способа?

При окислении сахара кислородом происходит выделение перекиси.

Существуют различные методы определения концентрации глюкозы в крови, но глюкозооксидазный является наиболее точным. Подоснова его состоит в том, что при взаимодействии сахара с кислородом воздуха происходит окисление реагента. В раствор выделяется перекись водорода.

Это вещество взаимодействует с ортотолуидином, образуя окрашенное соединение. Для поведения этой реакции необходимо присутствие специальных ферментов. При реакции окисления должна присутствовать глюкозооксидаза, а при окрашивании жидкости — пероксидаза.

Интенсивность окраски раствора будет зависеть от содержания глюкозы и быть более всего интенсивной при высоком ее содержании.

Суть глюкозооксидазного метода определения глюкозы

Оценка результата происходит с помощью количественного метода фотометрии через один и тот же промежуток времени. Обязательно использование калибровочного раствора, который содержит определенную заявленную норму сахара и, отталкиваясь от нее, можно судить о концентрации глюкозы в выделяемых жидкостях организма, чаще в крови.

Как проводится анализ?

Забор материала от больного осуществляется натощак. Для проведения теста используют венозную кровь в количестве 5 мл. Накануне диагностики больному показана строгая диета.

Это позволит судить о достоверности результата и исключить возможные погрешности анализа. За 2 дня перед изъятием крови пациент должен отказаться от вредных привычек употребления алкоголя и курения.

Также необходимо ограничить прием чрезмерно сладких блюд и по возможности избегать стрессовых ситуаций.

Для получения плазмы с сахаром проводится центрифугирование крови.

Чаще всего этот метод определения концентрации глюкозы выполняют способом центрифугирования, которым выделяют форменные элементы.

Количество сахара определяют уже в плазме. При добавлении к ней всех необходимых реагентов окраска наблюдается через 20 минут, если тест проводится при комнатной температуре.

Расчет уровня глюкозы проводится по калибровочному графику или с помощью правила порций.

Реактивы для исследования

Для определения сахара наиболее удобно использовать экспресс-методы определения глюкозы в крови. Это объясняется простотой в использовании и быстрым получением результата.

Кроме этого, больному не нужно идти в лабораторию или больницу. Но в отличие от глюкозооксидазного теста такая диагностика является недостоверной.

Так как не дифференцирует глюкозу от других сахаров и определяет их концентрацию вместе.

Основу глюкозооксидазной реакции составляет натрия хлорид 9% раствор и цинка сульфат 50%. Их добавляют на стадии центрифугирования крови. Кроме этого, используют буферный раствор с уксусной кислотой и ацетатом натрия.

Методом титрования определяют его рН на уровне 4,8.

После, добавляется глюкозооксидаза, из-за чего выделяется перекись водорода и пероксидаза, участвующая в окрашивании раствора до нужной концентрации для получения точного результата.

Нормы при проведении анализа

Глюкозооксидазное исследование крови проходят обязательно на пустой желудок и используют для этого плазму или сыворотку. Норма количества ее для взрослых как для женщин, так и для мужчин составляет 3,3—5,5. Для детей до 15-ти лет этот показатель немного ниже и колеблется в пределах 3,2—5,3.

У новорожденных глюкоза крови составляет 1,7—4,2. Увеличение показателей наблюдается при развитии у больного сахарного диабета или при нарушении толерантности к глюкозе.

Это состояние является преддиабетом, и если его вовремя не лечить, то в скором времени оно приведет к развитию этой тяжелой патологии.

Источник: http://EtoDiabet.ru/diab/obsledovaniya/glyukozooksidaznyj-metod.html

Глюкоза

Наиболее распространенный углевод в животном организме — глюкоза. Она играет роль связующего звена между энергетическими и пластическими функциями углеводов, поскольку из глюкозы могут образовываться все другие моносахариды, и наоборот — различные моносахариды могут превращаться в глюкозу.

Более 90% всех растворимых низкомолекулярных углеводов крови приходится на глюкозу; кроме того, в небольших количествах могут присутствовать фруктоза, мальтоза, манноза и пентозы, а при патологии и галактоза. Наряду с ними в крови содержатся связанные с белками полисахариды.

Особенно интенсивно глюкозу потребляют и используют для разнообразных нужд ткани центральной нервной системы, эритроциты, мозговое вещество почек.

В промежуточном обмене глюкоза используется для образования гликогена, глицерина и жирных кислот, аминокислот, глюкуроновой кислоты и гликопротеинов.

Концентрация глюкозы в крови является производной процессов гликолиза и окисления трикарбоновых кислот в ЦТК, гликогенеза и гликогенолиза в печени и мышечной ткани, глюконеогенеза в печени и почках, поступления глюкозы из кишечника.

В клинической практике обычно исследуют содержание глюкозы в крови, к определению концентрации других сахаров и гликогена прибегают значительно реже.

В крови человека глюкоза довольно равномерно распределена между плазмой и форменными элементами, установлено, что в венозной крови содержание сахара на 0,25‑1,0 ммоль/л (в среднем на 10%) меньше, чем в артериальной и капиллярной.

Известную диагностическую ценность представляет определение молочной и пировиноградной кислот, активности ряда ферментов углеводного обмена, сиаловых и гексуроновых кислот, серомукоидов, гликозилированного гемоглобина и других показателей.

Содержание глюкозы в моче зависит от ее концентрации в крови, хотя выделяется она как при нормальном, так и при повышенном уровне сахара крови.

При повышении концентрации глюкозы в крови преодолевается так называемый почечный порог (у здоровых людей лежит в области 8,3‑9,9 ммоль/л) и наступает глюкозурия.

При артериосклеротической почке, при диабете порог повышается и может не отмечаться глюкозурия даже при повышении концентрации глюкозы до 11,0‑12,1 ммоль/л.

Методы определения глюкозы в крови подразделяют на три группы: редуктометрические, колориметрические и энзиматические.

1. Редуктометрические методы:

  • титрометрический способ Хагедорна‑Йенсена основан на свойстве сахара восстанавливать при кипячении в щелочной среде железистосинеродистую и железосинеродистую соли калия. По степени этого восстановления титрометрически исследуют концентрацию сахара в крови. Важным преимуществом метода является дешевизна и возможность использования в любой лаборатории;
  • основанные на восстановлении нитробензолов, например, пикриновой кислоты в пикраминовую;
  • метод, основанный на способности глюкозы восстанавливать соли меди. Образующаяся одновалентная медь выступает в качестве промежуточного вещества. Окисляясь кислородом воздуха, она восстанавливает мышьяковомолибденовую или фосфорновольфрамовую кислоту, которые служат окончательным хромогеном.

Однако следует иметь в виду, что методы этой группы дают завышенные результаты (примерно на 20‑25%), так как в крови присутствует ряд соединений, не относящихся к углеводам, но обладающих восстановительными свойствами (мочевая кислота, глутатион, креатинин, аскорбиновая кислота);

2. Колориметрические методы. К ним относятся:

  • метод Сомоджи — реакция восстановления меди, находящейся в составе меднотартронового реактива, до закиси меди. Метод трудоемок, многостадиен, неспецифичен и в настоящее время практически не используется;
  • метод Фолина‑Ву — реакция восстановления тартрата меди в закись. Метод прост, недостатком является отсутствие строгой пропорциональности между интенсивностью получаемой окраски и концентрацией глюкозы;
  • определение концентрации глюкозы по Моррису и Роэ — дегидратация глюкозы под действием серной кислоты и превращение ее в оксиметилфурфурол, который конденсируется с артроном в соединение синего цвета. Требует чистейших реактивов и четкого соблюдения постояной температуры реакции;
  • ортотолуидиновый метод Гультмана в модификации Хиваринена-Никкила, состоящий в определении интенсивности окрашивания раствора, возникающего при взаимодействии ароматического амина ортотолуидина с альдегидной группой глюкозы в кислой среде. Этот способ точен и дает возможность более специфичного определения содержания глюкозы.
  • анилиновый метод, сохраняет чувствительность ортотолуидинового метода, но еще более специфичен.

3. Ферментативные методы:

  • основанный на гексокиназной реакции. Глюкоза под действием гексокиназы фосфорилируется за счет АТФ, образовавшийся Гл‑6‑Ф в присутствии дегидрогеназы восстанавливает НАДФ. Количество последнего определяют по увеличению светопоглощения в ультрафиолетовой области. Метод слишком дорогостоящий для практических лабораторий.
  • основанные на окислении глюкозы до глюкуроновой кислоты с помощью фермента глюкозооксидазы и образовании в ходе реакции перекиси водорода, которая (в разных модификациях):
Читайте также:  Что значит сахар в крови 5,5, 6,6, 7,7 и выше – расшифровка результатов анализа
◊ определяется химическим путем;
◊ при участии пероксидазы окисляет бесцветный ортотолидин, превращая его в окрашенное соединение зелено‑голубого цвета, прямолинейность зависимости окраски от концентрации глюкозы сохраняется в диапазоне от 1,1 до 22 ммоль/л;
◊ в присутствии фенола при участии пероксидазы окисляет 4‑амино­антипирин в окрашенное соединение розово-малинового цвета;
◊ в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина, который в щелочной среде окрашен в красный цвет.

4. Электрохимические методы, в которых используются электроды, содержащие иммобилизованные ферменты, в частности, глюкозооксидазу. Реакция регистрируется по количеству образованной перекиси водорода или по убыли кислорода, израсходованного на окисление глюкозы.

5. Диагностические полоски, использующие глюкозооксидазно‑пероксидазную реакцию и производные бензидина в качестве хромогена.

В качестве унифицированных принято три метода: титрометрический метод Хаггедорна-Йенсена, ортотолуидиновый метод и глюкозооксидазный метод с окислением о‑толидина.

Определение содержания глюкозы
ортотолуидиновым методом

Принцип

Глюкоза при нагревании с ортотолудином в присутствии серной кислоты дает сине-зеленое окрашивание.

Нормальные величины

Цельная кровь (указанный метод) 3,9‑5,5 ммоль/л
Плазма (тот же) 3,9‑5,5 ммоль/л
Моча (тот же) 0,06‑0,83 ммоль/л
или < 2,78 ммоль/сут

Определение содержания глюкозы глюкозооксидазным
методом по набору «Новоглюк»

Глюкозооксидазным методом можно определять количество глюкозы в сыворотке и плазме крови, цельной крови и спинномозговой жидкости.

Принцип

При окислении глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет 4‑аминоантипирин в присутствии фенола в окрашенное соединение розово‑малинового цвета, определяемое фотометрически.

Нормальные величины

Цельная кровь (ферментный с фенолом и аминоантипирином)
новорожденные 2,22‑4,44 ммоль/л
дети 3,33‑5,55 ммоль/л
взрослые 3,9‑5,5 ммоль/л
Сыворотка (тот же) 4,2‑6,6 ммоль/л
Цельная кровь (ферментный с ортотолидином) 3,1‑5,5 ммоль/л
Сыворотка и плазма (тот же) 3,0‑5,5 ммоль/л
Ликвор (тот же) дети 3,33‑4,44 ммоль/л
взрослые 2,75‑3,85 ммоль/л

Влияющие факторы

Завышенные результаты уровня глюкозы в крови наблюдаются после приема пищи, при применении кофеина, препаратов гормонов надпочечников, тироксина, пероральных контрацептивов, витамина РР (в больших дозах), диуретиков, при физических упражнениях, эмоциональном возбуждении и других стрессовых воздействиях. Влияние in vitro оказывают галактоза и другие моносахара сыворотки крови, аскорбиновая кислота, леводопа, метилдофа, парааминосалициловая кислота и другие.

Снижение концентрации отмечается после применения анаболических стероидов, антигистаминных препаратов, токсичных доз ацетилсалициловой кислоты, этанола. На результаты анализа влияет наличие гемолиза (выход глутатиона из эритроцитов), высокое содержание аскорбиновой и ацетилсалициловой кислоты в крови.

Клинико‑диагностическое значение

Кровь

Повышение концентрации глюкозы в крови (гипергликемия) отмечается при:

  • повышении гормональной деятельности гипофиза, надпочечников, щитовидной железы: феохромоцитома, тиреотоксикоз, акромегалия, синдром Кушинга;
  • заболеваниях поджелудочной железы: сахарный диабет (взрослый и юношеский), диабет беременных, острый и хронический панкреатиты, муковисцидоз, опухоли, гемохроматоз. Выраженная гипергликемия без кетоза встречаются у больных сахарным диабетом средней тяжести (или у лиц не страдающих им, с высоким уровнем эндогенного инсулина, предотвращающего развитие кетоза). Содержание глюкозы в крови может превышать 50 ммоль/л, в отличие от диабетического кетоацидоза, при котором уровень глюкозы вкрови часто ниже 33 ммоль/л;
  • хронических заболеваниях печени и почек;
  • раздражении ЦНС: кровоизлияния в мозг, травмы, опухоли, отравления окисью углерода, эфиром, синильной кислотой и т.п., менингит, эпилепсия;
  • остром инфаркте миокарда, тяжелой стенокардии, авитаминозе В1, при ожогах (первые сутки).

Гипогликемия встречается при:

  • заболеваниях поджелудочной железы: опухоль панкреатических островков, дефицит глюкагона;
  • тяжелых повреждениях печени: отравления мышьяком, хлороформом, алкоголем, салицилатами, антигистаминными препаратами, фосфором, тетрахлоридом углерода, бензолом, парацетамолом и т.п.;
  • заболеваниях печени, сопровождающихся нарушением гликогенообразования и глюконеогенеза;
  • эндокринных нарушениях: гипопитуитаризм, аддисонова болезнь, гипотиреоз;
  • заболеваниях почек с нарушением реабсорбции, заболевания кишечника с нарушением всасывания, большая потеря крови, несбалансированная диета и недоедание, спленомегалии у детей;
  • передозировке инсулина или пероральных противодиабетических препаратов.

Моча

Выведение глюкозы возрастает при всех случаях гипергликемии свыше 10 ммоль/л (почеч­ного порога). В этом случае глюкозурии могут быть физиологическими и патологическими:

  • к физиологическим относятся алиментарная глюкозурия, глюкозурия беременных и нейрогенная глюкозурия на почве стрессовых состояний,
  • патологическая глюкозурия обнаруживается при сахарном диабете, тиреотоксикозе, акромегалии, гиперплазии коры надпочечников, инфаркте миокарда, кровоизлияниях во внутренние органы, отравлениях морфином, фосфором, при острых инфекциях и нервных заболеваниях.

При нормогликемии глюкозурия может выявляться при повреждениях почечных канальцев — пиело- и гломерулонефриты, токсические поражения, почечный диабет (семейная почечная глюкозурия), нефропатии.

Снижение глюкозы в моче (вплоть до исчезновения) является признаком бактериурии.

Спинномозговая жидкость

Уровень глюкозы повышен при сахарном диабете, эпидемическом энцефалите, сифилисе ЦНС, гипергликемиях различной этиологии.

Уменьшение концентрации глюкозы определяется при остром пиогенном менингите, туберкулезном и криптококковом менингите, менингоэнцефалите, опухолях мягкой мозговой оболочки, саркоидозе.

Вы можете спросить или оставить свое мнение.

  • ВКонтакте

Download SocComments v1.3

Найти

Клиническая биохимия

Источник: http://biokhimija.ru/uglevody-krovi/glucoz-krovi

Глюкоза в крови

Определение глюкозы в крови – один из наиболее широко распространенных тестов в клинической лабораторной диагностике. Глюкозу определяют в плазме, сыворотке, цельной крови.

Согласно Руководству по лабораторной диагностике диабета, представленному Американской Ассоциацией диабета (2011 г.

), не рекомендуется измерять глюкозу в сыворотке крови при диагностике диабета, поскольку именно использование плазмы позволяет быстро центрифугировать образцы, чтобы предотвратить гликолиз, не дожидаясь образования сгустка.

Различия в концентрации глюкозы в цельной крови и плазме требуют особого внимания при трактовке результатов.

Концентрация глюкозы в плазме выше, чем в цельной крови, причем различие зависит от величины гематокрита, следовательно, использование некоего постоянного коэффициента для сопоставления уровня глюкозы в крови и плазме может привести к ошибочным результатам. Согласно рекомендациям ВОЗ (2006 г.

), стандартным методом для определения концентрации глюкозы должен быть метод определения глюкозы в плазме венозной крови. Концентрация глюкозы в плазме венозной и капиллярной крови не отличается натощак, однако через 2 ч после нагрузки глюкозой отличия существенны (Табл.).

Концентрация глюкозы, ммоль/лЦельная кровьПлазмавенознаякапиллярнаявенознаякапиллярная
Норма
Натощак 3,3–5,5 3,3–5,5 4,0–6,1 4,0–6,1
Через 2 часа после ПГТТ 12,2

На уровень глюкозы в биологическом образце значительное влияние оказывает его хранение. При хранении образцов при комнатной температуре в результате гликолиза происходит существенное снижение содержания глюкозы.

Для ингибирования процессов гликолиза и стабилизации уровня глюкозы в пробу крови добавляют фторид натрия (NaF). При взятии образца крови, согласно докладу экспертов ВОЗ (2006 г.

), если немедленное отделение плазмы невозможно, образец цельной крови должен быть помещен в пробирку, содержащую ингибитор гликолиза, которую следует хранить во льду до выделения плазмы или проведения анализа.

Показания к исследованию

  • Диагностика и мониторинг СД;
  • заболевания эндокринной системы (патология щитовидной железы, надпочечников, гипофиза);
  • заболевания печени;
  • ожирение;
  • беременность.

Особенности взятия и хранения образца. Перед исследованием необходимо исключить повышенные психо-эмоциональные и физические нагрузки.

Предпочтительно – плазма венозной крови. Образец следует отделить от форменных элементов не позднее, чем через 30 мин после взятия крови, избегать гемолиза.

Образцы стабильны не более 24 ч при 2–8 °C.

Метод исследования. В настоящее время в лабораторной практике наибольшее распространение получили ферментативные методы определения концентрации глюкозы – гексокиназный и глюкозооксидазный.

Повышенные значения

  • СД 1 или 2 типа;
  • диабет беременных;
  • заболевания эндокринной системы (акромегалия, феохромоцитома, синдром Кушинга, тиреотоксикоз, глюкоганома);
  • гемахроматоз;
  • панкреатит острый и хронический;
  • кардиогенный шок;
  • хронические заболевания печени и почек;
  • физические упражнения, сильное эмоциональное напряжение, стресс.

Пониженные значения

  • Передозировка инсулина или гипогликемических препаратов у больных СД;
  • заболевания поджелудочной железы (гиперплазия, опухоли), вызывающие нарушение синтеза инсулина;
  • дефицит гормонов, обладающих контринсулярным действием;
  • гликогенозы;
  • онкологические заболевания;
  • тяжелая печеночная недостаточность, поражения печени, вызванные отравлением;
  • заболевания ЖКТ, нарушающие всасывание углеводов.
  • алкоголизм;
  • интенсивная физическая нагрузка, лихорадочные состояния.

Источник: https://www.cmd-online.ru/vracham/spravochnik-vracha/glyukoza-v-krovi/

Количественное определение глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом

( по окислению фенофталеина)…………………………………………………………………………………………………………………………..стр6

Лабораторная работа №7

Определение глюкозы о- толуидиновым методом…………………………………………………………………………………………….стр6

Лабораторная работа №8

Качественная реакция на определения сахара в моче- реактив Ниландера…………………………………………………..стр7

Лабораторная работа №9

Турбидиметрический метод определения бета-липопротеидов сыворотки крови

по Бурштеиу и Самаи…………………………………………………………………………………………………………………………………….стр7

Лабораторная работа № 10

Реакция образования иодоформа ( на ацетоновые тела)…………………………………………………………………………………..стр8

Лабораторная работа №11

Определение содержания холестерина в сыворотке крови (метод Ильке)……………………………………………………..стр8

Лабораторная работа №12

Количественное определение общей кислотности. Пирамидоновая проба на обнаружение крови в желудочном соке. Реакция Уффельмана на молочную кислоту…………………………………………………………………………………………….стр9

Лабораторная работа №13

Определение активности ГГТП сыворотки крови………………………………………………………………………………………….стр10

Лабораторная работа №14

Количественное определение мочевины в сыворотке крови…………………………………………………………………………стр10

Лабораторная работа №15

Количественное определение витамина С в сыворотке крови………………………………………………………………………..стр11

Лабораторная работа №16

Определение содержания витамина С в моче…………………………………………………………………………………………………..стр11

Лабораторная работа №17

Коагуляционная проба Вельтмана…………………………………………………………………………………………………………………….стр12

Читайте также:  Влияет ли курение на сахар в крови и можно ли курить при сахарном диабете 1 и 2 типа

Лабораторная работа №18

Определение общего гемоглобина методом щелочной денатурации………………………………………………………………..стр12

Лабораторная работа №19

Определение билирубина методом Иедрашека………………………………………………………………………………………………..стр13

Лабораторная работа №20

Определение кальция, фосфора в сыворотке крови титрометрическим методом

с применением мурексида…………………………………………………………………………………………………………………………………стр14

Лабораторная работа №21

Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи………………………………………..стр14

Лабораторная работа №22

Определение белка слюны биуретовым методом……………………………………………………………………………………………стр15

Лабораторная работа № 1

Количественное определение активности амилазы слюны…………………………………………………………………………….стр16

Лабораторная работа №2

Определение активности щелочной фосфатазы слюны…………………………………………………………………………………..стр16

Лабораторная работа №3

Определение трансаминазной активности слюны…………………………………………………………………………………………стр17

Лабораторная работа №4

Определение кальция в слюне титрометрическим методом с применением мурексида……………………………..стр18

ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2

1.Калориметр включить в сеть за 15 мин. до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучек).

2. Установить необходимый светофильтр. При переключении светофильтров ручка «чувствительность» должна находится в положении «1» (красный светофильтр 670- «1», зеленый светофильтр 540- «1»), а ручка «установка 100 Грубо» в крайнем левом положении (это предохраняет прибор от перегрузки и порчи).

3. В световой поток поместить кювету с контрольным раствором по отношению к которому производят измерения.

4. Во вторую ячейку кюветодержателя поместить кювету с исследуемым раствором.

5. Закрыть крышку кюветного отделения.

6. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 вначале ГРУБО, затем ТОЧНО установить отсчет 100 по шкале калориметра.

7. Поворотом ручки под кюветным отделением до упора, ввести в световой поток кювету с исследуемым раствором.

8. Снять отсчет по шкале Д в единицах оптической плотности.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА СЫВОРОТКИ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Значение метода:

1) Нормопротеинемия 60-80г/л.

2) Гипопротеинемия:

1. Относительная (гидремия при нагрузке водой, водных отравлениях).

2. Абсолютная вследствие:

а) подавления синтеза белка (альбуминов при нарушении функции гепатоцитов, глобулинов при всех формах недостаточности РЭС).

б) потери белков преимущественно альбуминов (нарушение функции желудочно-кишечного тракта, нарушение почечного фильтра, кровоизлияния, увеличение проницаемости капилляров — отеки, обширные экссудаты, обширные выпоты в серозные полости);

в) усиление расхода альбуминов при голодании.

3) Гиперпротеинемия:

1. Относительная (обезвоживание)

2. Абсолютная вследствии усиления синтеза глобулинов (злокачественные новообразования, ряд форм лейкозов, инфекционное или токсическое раздражение РЭС).

Принцип метода: Биуретовый метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплексного соединения меди с пептидными группами белка. Характерная фиолетовая окраска раствора пропорциональна числу пептидных групп.

Ход определения: К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл биуретового реактива (состав : СuSO4, 5H2O, NaOH, сегнетова соль). Смешивают, избегая образования пены. В контрольную

пробу к 0,1мл физ.раствора добавляют 5мл биуретового реактива. Через 30 мин измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб на фотоэлектроколориметре. Зеленый светофильтр в кювете толщиной 1см против контроля. Окраска стабильная в течении 1 часа.

Расчет: Концентрацию белка в сыворотке крови определяют по калибровочному графику.

Норма 63-83 г/л.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРАНСАМИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ.

Значение метода:Аминотрансферазы (АЛТ и АСТ) представляют собой ферменты, участвующие в переносе аминогрупп от альфа-аминокислот к альфа- кетокислотам. Коферментом в этой реакции является производная Вит В6- пиридоксальфосфат.

Аминотрансферазы относятся к широко распространенным ферментам в организме, к ряду внутриклеточных. В сыворотке крови активность этих ферментов в норме не высока.

Органические поражения при острых и хронических заболеваниях, сопровождаются деструкцией клеток, приводят к выходу трансаминаз из очага поражения в кровь.

АЛТ-содержится в высоких концентрациях в печени и в меньших количествах в скелетных мышцах, почках, сердечной мышце.

Значительное повышение (в 10-100 раз) активности АЛТ в крови наблюдается при вирусном гепатите, токсическом некрозе печени.

Особое значение имеет определение АЛТ в инкубационный период вирусного гепатита, а также для постановки диагноза при безжелтушной форме этого заболевания и эффективности лечения.

АСТ- широко распространена с высокими концентрациями в сердце, печени, скелетных мышцах, почках, эритроцитах. Повреждение любой из этих тканей может привести к повышению концентрации АСТ в сыворотке крови.

Особое значение определения АСТ имеет для диагностики инфаркта миокарда и динамики заболевания.

Уже через три часа после заболевания АСТ повышается, в сыворотке на 4-5 сутки наблюдается пик подъема, к 7 суткам активность АСТ должна вернуться к норме.

Активность АСТ определяется также в ротовой жидкости. Источником АСТ являются эпителиальные клетки, фибробласты, лейкоциты крови и плазма крови. В норме активность АСТ в ротовой жидкости следовая. Увеличение активности АСТ говорит о повреждении тканей парадонта и может служить одним из признаков гингивита.

Принцип метода: О трансаминазной активности сыворотки крови судят по количеству ПВК, образующейся при переаминировании из аланина или в результате декарбоксилирования щавелеуксусной кислоты, образующейся при переаминировании из аспарагиновой кислоты (АСТ). ПВК взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином, с образованием 2,4-динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты. При обработке динитрофенилгидразона щелочью образуется окрашенное в красный цвет соединение. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству ПВК.

Ход работы: В пробирку вносят 0,1мл сыворотки и 0,5мл субстратной смеси, составленной из аланина и альфа-кетоглутаровой кислоты.

Пробирку помещают в термостат при 37 град С на 15 минут, затем добавляют 0,5мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и оставляют стоять при комнатной температуре на 10 минут, после чего приливают 5мл NаОН и через 10-15 минут колориметрируют на ФЭКе в кювете на 0,5см с зеленым светофильтром против контроля.

Контроль: К 0,2мл Н2О приливают 1мл субстратной смеси, 1мл 2,4- динитрофенилгидразина и через 15 минут 10мл NаОН (обязательно соблюдать порядок добавления реактивов). После фотометрирования используют калибровочный график. Активность АЛТ выражают в МКМ ПВК, образованной под действием ферментов, содержащихся в 1мл слюны за час при 37 град

Норма: АЛТ- 0,1-0,68 мкм/л.ч

АСТ- 0,1-0,45 мкм/л.ч

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3



Источник: https://infopedia.su/12xcda.html

Определения глюкозы в крови

Категория: Эндокринология

В норме уровень глюкозы в плазме или сыво­ротке натощак колеблется в пределах 70-110 мг% (3,9-6,1 ммоль/л).

Показатели в плазме или сыво­ротке надежнее, чем в цельной крови, так как не за­висят от гематокрита и отражают содержание глю­козы в интерстициальном пространстве, откуда ее получают ткани. Кроме того, плазма и сыворотка лучше подходят для автоматического анализа.

В этих средах отсутствуют форменные элементы, и поэтому концентрация глюкозы в них на 10-15% выше, чем в цельной крови.

Хотя в лабораториях анализ цельной крови на сахар проводят редко, больные диабетом в процессе самоконтроля ис­пользуют именно цельную капиллярную кровь. Недавно появились модифицированные рефлекто­метры, прямо показывающие уровень глюкозы в сыворотке, что лишает больного и врача необхо­димости производить расчеты.

Венозная кровь

Кровь собирают в пробирки с фторидом натрия, предотвращающим гликолиз, из-за которого уро­вень глюкозы может оказаться заниженным. В от­сутствие таких пробирок пробы крови сразу же (не позднее 30 минут) центрифугируют, и плазму или сыворотку хранят при 4°С.

В лабораториях содержание глюкозы в плазме обычно определяют ферментативными (глюкозо- оксидазным или гексокиназным), колориметриче­скими (а-толуидиновым) или автоматическими методами.

Последние основаны на восстановлении соединений меди или железа сахарами сыворотки после ее диализа.

При всем удобстве автоматиче­ских методов они не специфичны для глюкозы, так как реагенты взаимодействуют и с другими восста­навливающими веществами (содержание которых повышено при азотемии и при высоком потребле­нии аскорбиновой кислоты).

Капиллярная кровь

Измерения глюкозы в капиллярной крови, про­изводимые самим больным в домашних условиях, имеют важнейшее значение. У больных сахарным диабетом 1 типа, пытающихся осуществлять жест­кий контроль гликемии, такие измерения совер­шенно обязательны.

Содержание глюкозы в капил­лярной крови определяют с помощью тест-полосок (пропитанных глюкозооксидазой, глюкозодегид- рогеназой или гексокиназой), помещая их в глюко­метр или амперметр. В настоящее время выпуска­ется множество таких приборов.

Все они достаточ­но точны, но различаются скоростью работы, необходимым объемом крови и ценой. Лучшие из них требуют всего 0,3 мл крови и выдают резуль­тат меньше чем через 7 секунд.

Более дорогие моде­ли снабжены компьютером, вычисляющим сред­ние показатели, и, будучи присоединенными к принтеру, записывают показания в цифровой или графической форме. Для прокола пальца использу­ют специальный ланцет — иглу 28-30 калибра (во врачебных кабинетах и больницах пользуются сменными иглами).

Существуют и модели для оп­ределения уровня глюкозы в пробах крови, взятых не из пальца, а из других мест (предплечье, бедро). Однако быстро развивающаяся гипогликемия регистрируется в крови из предплечья на 5-20 минут позднее, чем в крови из пальца.

Клиницист должен знать о возможных погреш­ностях измерения глюкозы при самоконтроле. Во-первых, ряд старых глюкометров калиброваны по уровням глюкозы в цельной крови, а тест-полос- ки реагируют на глюкозу в плазме. Поэтому показа­ния таких приборов следует увеличить на 10-15%.

Читайте также:  Мороженое при диабете - стоит ли отказываться от вкусного десерта?

Во-вторых, увеличение или снижение гематокрита соответственно снижает или повышает результаты измерений. По-видимому, эритроциты препятству­ют диффузии плазмы в слой реагентов. В-третьих, глюкометры и тест-полоски рассчитаны на колеба­ния концентрации глюкозы в пределах 60-160 мг%, и при больших или меньших ее концентрациях точ­ность измерений может снижаться на целых 20%.

В-четвертых, при высоком напряжении кислорода в крови амперометрические системы, основанные на глюкозооксидазном методе, занижают концен­трацию глюкозы, и если больной дышит кислоро­дом, лучше использовать системы, основанные на глюкозодегидрогеназном методе.

Самоконтроль требует обучения больных приемам отбора проб крови и правилам измерения, а также точной калиб­ровки используемых приборов. В клиниках необхо­димы строгий контроль качества анализов и квалификации персонала лабораторий.

Интерстициальная жидкость

В настоящее время существуют системы, позво­ляющие непрерывно контролировать уровень глю­козы с помощью подкожно введенного сенсора (сходного с канюлей инсулиновой помпы).

Такие системы регистрируют концентрацию глюкозы в интерстициальной жидкости на протяжении 72 часов, сразу же сигнализируя об опасном сниже­нии или повышении уровня сахара. Во избежание ошибки результаты измерений рекомендуется про­верять путем определения концентрации глюкозы в капиллярной крови.

В системах другого типа интерстициальная жидкость экстрагируется из непо­врежденной кожи методом обратного ионтофореза (слабым электрическим током). При этом возможно раздражение кожи; кроме того, повышенная потли­вость искажает результаты измерений.

Все эти сис­темы требуют калибровки по содержанию глюкозы в крови из пальца. Они особенно полезны для выяв­ления эпизодов бессимптомной гипогликемии в ночное время.

Поделитесь ссылкой:

Источник: http://med-slovar.ru/endokrinologiya/endo/974-opredeleniya-glyukozy-v-krovi

Работа № 1. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом

⇐ Предыдущая46474849505152535455Следующая ⇒

Принцип метода.Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием пероксида водорода, при разрушении которого под влиянием пероксидазы происходит конденсация фенола и p-аминоантипирина в окрашенное соединение. Реакция протекает по схеме:

Глюкоза + О2 + Н2О ¾¾¾¾¾¾¾¾® глюконат + Н2О2;

                                       глюкозооксидаза

2Н2О2 + фенол + 4-аминоантипирин -¾¾® 4(n-бензохинонмоно- + 4Н2О.

               (п-аминофеназон)  пероксидаза     имино)-феназон

                                                                 (цветной хиноимин)

Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации глюкозы в крови.

Ход работы:1. В пробирки внести реактивы в соответствии с указанными объемами:

Отмерить, мл Опытная проба Стандартная проба Контрольная проба
Сыворотка крови 0,02
Стандартный раствор глюкозы 0,02
Дистиллированная вода 0,02
Реактив для определения глюкозы 3,0 3,0 3,0

Пробы перемешивают и инкубируют 30 мин. в термостате при 370С. Измеряют оптическую плотность опытной (Е1) и стандартной пробы (Е2) против контрольной в кювете 0,5 см, при длине волны 480-520 нм. Измерение должно быть проведено до истечения 5 минут.

Содержание глюкозы определяют путем расчета по формуле:

С глюкозы (ммоль/л) = Е1/Е2 ×10

Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Работа № 2. Определение глюкозы в крови по цветной реакции с орто-толуидином.

Принцип метода. Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом.

 Глюкоза при нагревании с о-толуидином в кислой среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови и определяется колориметрически на ФЭКе.

Ход определения. В центрифужную пробирку налить 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдуть на стенку пробирки 0,1 мл крови, взятой из пальца. Содержимое пробирки взболтать и центрифугировать 5-7 мин при 1500 об/мин.

Взять две пробирки. В первую (опыт) прилить 0,5 мл центрифугата, во вторую (контроль) — 0,5 мл 3% раствора трихлорукусусной кислоты и в обе пробирки добавить по 4,5 мл 0-толуидинового реактива. Пробирки поместить на 8 мин (точно!) в кипящую водяную баню и сразу охладить под водопроводной водой до комнатной температуры.

Опытную пробу колориметрировать против контроля или дистиллированной воды на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при красном (600-650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.

Расчет произвести по калибровочному графику или с применением стандартного раствора глюкозы.

Стандартная проба.Стандартную пробу проводят как опытную, но вместо крови используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (1,0 г/л), а в случае высокого содержания сахара в крови 16,65 ммоль/л (3,0 г/л) или 27,75 ммоль/л (5,0 г/л).

Расчет произвести по формуле:

Соп = (Сст × Еоп) / Ест =  ммоль/л глюкозы или г/л глюкозы, где

Соп — концентрация глюкозы в опытной пробе в ммоль/л или г/л,

Сст — концентрация глюкозы в стандартной пробе в ммоль/л или г/л,

Еоп — оптическая плотность опытной пробы,

Ест — оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

Работа № 3. Качественное обнаружение глюкозы в моче при помощи индикаторной бумаги «Глюкотест».

Принцип метода. “Глюкотест” приготавливается путем пропитки полосок фильтровальной бумаги 0,5х5 см смесью, содержащей глюкозооксидазу, пероксидазу и краситель. При смачивании бумаги раствором, содержащим глюкозу, происходит окисление глюкозы под действием фермента глюкозооксидазы.

Образующаяся при этом перекись водорода разлагается ферментом пероксидазой с окислением содержащего в тесте красителя.

Интенсивность изменения окраски в определенной степени пропорциональна содержанию глюкозы в растворе, поэтому “Глюкотест” используется и для полуколичественного определения содержания глюкозы в моче (от 1,0 до 20 г/л и выше).

Ход работы. Бумажку “Глюкотест” погрузить в исследуемую мочу так, чтобы нанесенная на бумажку желтая полоса была смочена.

Немедленно извлечь бумажку, положить смоченным концом на пластмассовую пластинку и через 2 мин сравнить изменившуюся окраску цветной полосы со шкалой, имеющейся в комплекте.

Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.

Клинико-диагностическое значение определения содержания глюкозы в моче.В моче здорового человека глюкоза практически не обнаруживается. В суточном количестве мочи может содержаться до 125-130 мг глюкозы.

Почечный порог глюкозы зависит от величины гипергликемии, продолжительности ее, состояния почек и многих других причин. Различают гипергликемическую глюкозурию и нормогликемическую. Концентрационный почечный порог – предельно низкая концентрация вещества, при которой оно появляется в моче — для глюкозы – 9-10 ммоль/л.

Нормогликемическая глюкозурия связана, главным образом, с нарушением реабсорбции глюкозы в почечных канальцах.

Работа № 4. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче.

Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.

Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:

Компоненты

Пробы крови, мл

Пробы мочи, мл

опытная контрольная опытная контрольная
Суспензия субстрата 1 1 1 1

Инкубация в течение 5 мин. при + 37°С

Сыворотка крови 0,10
Моча 0,05
Дистиллированная вода 0,10 0,05

Инкубация в течение 15 мин. при 37°С

Осаждающий раствор 2 2 2 2
Активность амилазы Норма: 130-150 Е/л Норма: 1,00-2,00 Е/мл

Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.

Активность фермента находят по калибровочному графику.

Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче:у человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.

У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче — от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.

Работа № 5. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.

Ход работы. У кролика из краевой вены уха или у крысы из хвостовой вены набирают 0,1 мл крови и определяют о-толуидиновым методом содержание глюкозы в крови.

Затем у животного выстригают на боку шерсть, протирают кожу спиртом и водят подкожно 0,1 % раствор адреналина из расчета 0,1 мл на 1 кг веса и через 30 минут повторно определяют содержание глюкозы в крови.

⇐ Предыдущая46474849505152535455Следующая ⇒


Источник: https://stydopedya.ru/1_103762_rabota—opredelenie-kontsentratsii-glyukozi-v-sivorotke-krovi-glyukozooksidaznim-metodom.html

Ссылка на основную публикацию